Enzim nitrogenase, selain mereduksi N2 menjadi NH3, dapat mereduksi senyawa-senyawa tertentu lainnya seperti asetilen. Uji ini di dasarkan atas reduksi C2H2 menjadi C2H4 yang dikatalis oleh enzim nitrogenase (Rao, 1986). Kepekaan metode yang berdasarkan gas kromatografi ini dapat mendeteksi ativitas nitrogense sampai pada tingkat yang paling rendah. Kepekaan metode ARA ini bermanfaat untuk pengamatan penambatan N2 dengan gas. Reaski reduksi N2 menjadi ammonia adalah :
N2 + 8H+ + 8e- 2NH3 + H2
Sedangkan konversi asetilena menjadi etilena terjadi melalui reaksi :
Reduksi N2 memerlukan 8 elektron, sedangkan reduksi asetilena memerlukan dua electron. Sehingga reduksi empat molekul asetilena sama dengan reduksi satu molekul N2. Nisbah yang dihasilkan dari pengukuran metode ARA , asetilena yang dirduksi terhadap nitrogen yang dihambat adalah 4 : 1 (Hairiah, 2005). Bagian yang diujikan pada pengukuran ARA ini meliputi bagian akar tanaman, baik yang telah membentuk akar atau belum siap membentuk akar.
Secara umum proses pengukuran dengan metode ARA adalh sebagai berikut; sample yang akan diuji diinokulasikan dalam botol serum, ataupun wadah yang tepat dengan asetilena C2H2 yang dimurnikan dalam temperature, periode inkubasi dan penyinaran yang baku. Pada akhir inkubasi, gas dari wadahnya di buang untuk analisis etilen C2H4 dengan pemisahannya melalui gas kromatografi yang diikuiti dengan deteksi oleh ionisasi cahaya atau kolorimetri. Setelah koreksi untuk sejumlah kecil C2H2 yang ada sebagai ketidak murnian dalam jumlah C2H4 yang tercatat, jumlah reduksi nitrogen yang terfiksasi ditentukan oleh seampai sejauh mana terjadi reduksi C2H2 menjadi C2H4. mol N2 yang terfiksasi diperoleh dengan membagi mol C2H2 yang tereduksi menjadi C2H4 dengan angka 4. Angka ini didasarkan atas rasio (nisbah) electron untuk mereduksi asetilen dan nitrogen. (Madigan et al,2000).
Pengujian ARA untuk efektifitas infeksi Frankia dapat memalui nodul akar beberapa tanaman seperti Casuarina equisetifolia (sengon laut) yang biasanya tumbuh pada kondisi tanah dengan stress garam tinggi. Pengukuran infeksi Frankia dilakukan untuk mengetahui efektifitasnya sehingga dapat dikembangkan penggunaannya untuk peningkatan nitrogen tersedia bagi tanman yang dibudidayakan pada daerah strss garam tinggi, atau lahan reklamasi tambang.
Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan oleh Sasakawa dkk pada tahun 2002 di Universitas Okayama, Jepang. Efektifitas infeksi bakteri Frankia pada nodul akar tanaman Casuarina equisetifolia menggunakan metode ARA diperoleh hasil 6.29 + 1.57 µmol/berat kering nodul/jam. Dibandingkan efektifitas infeksi bakteri Frankia pada nodul akar tanaman Alnus sieboldiana, menunjukkan besar reduksi 1.91 + 0.61 µmol/berat kering nodul/jam Hasil pengukuran efektifitas infeksi bakteri Frankia pada nodul akar tanaman satu dengan yang lain akan bervariasi tergantung pda beberapa factor antara lain ; morfologi nodul akar tanaman, respon akar tanaman pada bakteri Frankia, kondisi temperature inkubasi, serta kemampuan fiksasi N pada masing-masing nodul akar.
Metode pengukuran ARA ini cenderung lebih mudah dilakukan karena terlepas dari pengamatan monekuler dari suatu system sel. Pengukuran metode ARA ini banyak diterapkan untuk pengukuran fiksasi N pada suatu system yang kurang diketahui lebih lanjut. Hasil yang ditunjukan dengan sejumlah etilen yang merupakan hasil reduksi dari acetylene dapat di setarakan secara pasti dengan reduksi nitrogen pada proses fiksasi nitrogen yang dilakukan akar tanaman. Dibandingkan dengan metode pengikuran fiksasi N dengan metode penggunaan 15N, metode ARA ini cenderung lebih murah dan dapat dilakukan secara berkala atau dengan waktu periode pengukuran yang ditentukan. (Madigan et al, 2000)
III. PENUTUP
Frankia yang merupakan kelompok mikrobia bakteri gram positive, dan memiliki filament, selanjutnya di kelompokkan secara terpisah dalam kelompok actinomycetes (Madigan et al, 2000). Beberapa contoh tanaman non legume yang berasosiasi dengan Frankia untuk penyediaan N antara lain Alnus, Casuarina, Elaeagnus, Myrica, Corlaria, dan beberapa jenis tanaman actinorhizal lainnya (Benson, 1993). Untuk kebutuhan lebih lanjut, Frankia dapat diisolasi dan dikembangkan untuk diketahui kuantitas dan kualitas kemampuan simbiotiknya dengna tanaman non legume lainnya.
Pengukuran fiksasi nitrogen dalam bintil akar secara umum dan yang sering dilakukan adalah dengan metode eksperimen jangka panjang dengan inokulasi pada tanaman. Pengamatan didasarkan pembentukan bintil akar dan tingkat efektifitasannya dengan pengukuran berat kering akar, melalui pengecatan akar. Pengamatan lebih lanjut mengenai tingkat fiksasi nitrogen pada akar adalah dengan pengukuran N total tanaman dari tanaman yang membentuk bintil dengan tanaman yang tidak membentuk bintil pada perakarannya. (Rao, 1982).
Metode pengukuran efektifitas bakteri penambat N dapat dilakukan dengan Acetylene Reduction Assay (ARA). Pengukuran dengan metode ARA ini akan didapatkan hasil secara kuantitatif dari efektifitas fiksasi nitrogen pada bintil akar tanaman. (Hairiah, 2006). Pengukuran fiksasi nitrogen dengan metode ARA dapat dilakuan pada semua jenis bintil akar, dan tak terkecuali pada bintil akar tanaman non legume yang berasosiasi dengan Frankia.
Secara umum proses pengukuran dengan metode ARA adalh sebagai berikut; sample yang akan diuji diinokulasikan dalam botol serum, ataupun wadah yang tepat dengan asetilena C2H2 yang dimurnikan dalam temperature, periode inkubasi dan penyinaran yang baku. Pada akhir inkubasi, gas dari wadahnya di buang untuk analisis etilen C2H4 dengan pemisahannya melalui gas kromatografi yang diikuiti dengan deteksi oleh ionisasi cahaya atau kolorimetri. Setelah koreksi untuk sejumlah kecil C2H2 yang ada sebagai ketidak murnian dalam jumlah C2H4 yang tercatat, jumlah reduksi nitrogen yang terfiksasi ditentukan oleh seampai sejauh mana terjadi reduksi C2H2 menjadi C2H4. mol N2 yang terfiksasi diperoleh dengan membagi mol C2H2 yang tereduksi menjadi C2H4 dengan angka 4. Angka ini didasarkan atas rasio (nisbah) electron untuk mereduksi asetilen dan nitrogen. (Madigan et al,2000).
Metode pengukuran ARA ini cenderung lebih mudah dilakukan karena terlepas dari pengamatan monekuler dari suatu system sel. Pengukuran metode ARA ini banyak diterapkan untuk pengukuran fiksasi N pada suatu system yang kurang diketahui lebih lanjut. Hasil yang ditunjukan dengan sejumlah etilen yang merupakan hasil reduksi dari acetylene dapat di setarakan secara pasti dengan reduksi nitrogen pada proses fiksasi nitrogen yang dilakukan akar tanaman. Dibandingkan dengan metode pengikuran fiksasi N dengan metode penggunaan 15N, metode ARA ini cenderung lebih murah dan dapat dilakukan secara berkala atau dengan waktu periode pengukuran yang ditentukan.
Dengan diketahuinya jumlah reduksi nitrogen dengan metode ARA, maka dapat dilakukan langkah selanjutnya untuk pengembangan stari bacteria frankia atau strain bakteri lainnya. Diharapkan dengan metode pengukuran reduksi nitrogen dengan metode ARA dapat diambil langkah bioteknologi selanjutnya untuk proses inokulasi pada tanaman lain sehingga dapat meningkatkan ketersediaan N pada lahan ataupun pada lahan yang ekstrem
Tidak ada komentar:
Posting Komentar